DNA双链断裂（double-strand break, DSB）是一种严重的DNA损伤形式。断裂诱导复制（Break-induced replication ，BIR）是一种依赖同源序列模板进行DNA合成并修复的过程，专门修复单一末端的DNA双链断裂（one-ended DSB），比如破裂的复制叉结构（replication fork collapse）和侵蚀的端粒结构（telomere erosion）。BIR途径和癌细胞的基因组不稳定性密切相关。BIR过程中，DSB的双链末端首先被加工成3’单链末端并结合重组酶Rad51，其次重组酶驱动单链DNA寻找并侵入同源序列，并以同源序列作为模板合成新的DNA。此前的研究表明BIR能沿着染色体朝端粒方向进行长距离的DNA复制。但由于技术上的限制，BIR起始、延伸、以及通过复制障碍结构的机制并不清楚。
2021年1月20日，来自美国艾奥瓦大学的Anna Malkova实验室和贝勒医学院的Grzegorz Ira 实验室合作在Nature杂志上在线发表了题为 Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks 的研究论文，通过开发了一个新的实验技术，揭示了BIR的动态过程以及复制障碍区域（如重复序列和转录活跃区域）对BIR进程的影响。
研究人员首先开发了一个基于Droplet Digital PCR（ddPCR）的新方法——AMBER（Assay for Monitoring BIR Elongation Rate）来追踪酿酒酵母中BIR的动态过程。AMBER实验显示BIR的平均合成速率约为0.5 kb每分钟，约是S期DNA复制速率的六分之一。此前的研究显示DNA解旋酶Pif1和DNA聚合酶Polδ的Pol32亚基参与BIR，但其参与的具体步骤并不清楚。通过AMBER，研究人员发现Pif1或Pol32缺失的突变体保留有部分BIR复制的起始功能，但无法进行长距离的复制延伸，说明二者分别在起始和延伸阶段发挥不同的作用。
与S期的DNA复制不同，BIR过程中前导链和后随链的合成是不同步的，后随链以新合成的前导链为模板进行复制，但两条链合成之间的偶联程度并不清楚。AMBER实验显示在引物酶Primase失活的pri2-1突变体中，BIR合成的最远距离是25 kb （野生型中超过90 kb）。这说明前导链和后随链合成的解偶联仅限于20-30 kb，而后随链能稳定长距离的前导链合成。
为了解复制障碍区域对BIR的影响，研究人员首先将人类端粒重复序列（Interstitial telomere sequences，ITSs）插入BIR的同源模板染色体中。AMBER实验显示大多数在ITS区域前成功起始的复制无法通过ITS区域。脉冲场凝胶电泳显示约四分之三的受试细胞中的BIR在ITS区域停止。全基因组测序显示部分细胞在BIR停止处形成稳定的酵母端粒结构。此外，少部分细胞能进行延迟的低水平的BIR。这些结果说明ITS序列能影响BIR的行进，这可能通过特异结合端粒序列的蛋白实现。
为研究转录活跃区域（另一种复制障碍区域）对BIR的影响，研究人员在BIR的同源模板中分别插入与BIR同向（Co-Directional）和反向（Head-On）的半乳糖诱导的活跃表达元件GAL1-HIS3。AMBER实验显示BIR无法通过位于复制起始位置的反向转录元件，但能通过位于复制起始位置下游6 kb的反向转录元件，并且能通过位于复制起始位置的同向转录元件。此外，BIR的水平与复制起始位置的反向的doxycycline调控的TET(on)-HIS3表达元件的转录水平呈负相关。这些结果说明反向的转录活跃元件能阻碍BIR的起始，但不影响BIR的延伸过程。此外，与BIR反向的转录元件还导致了修复产物中突变和非正常的染色体重组水平的升高。
为更深入了解BIR与活跃转录之间的冲突，研究人员对冲突区域的转录过程进行了更细致的探索。RNA聚合酶PolII的ChIP-qPCR分析显示与位于BIR起始位点的反向和同向的GAL1-HIS3具有相同的PolII结合水平，但是反向的GAL1-HIS3的mRNA表达水平显著低于同向的GAL1-HIS3，说明BIR和反向表达元件之间的冲突导致RNA聚合酶卡在DNA模版上而形成稳定的障碍物阻挡BIR合成和mRNA的转录。ChIP-seq分析显示BIR通过的区域中PolII在反向表达元件的转录终止位点（transcription end site，TES）富集。这些结果说明BIR与反向的转录过程互相阻滞。
总之，这项工作通过新的AMBER实验揭示了不同BIR参与者在BIR起始和延伸过程中的作用，并阐述了复制障碍区域如端粒重复序列和转录活跃位点对BIR的影响。基于BIR是用于恢复破裂的复制叉结构的通路的理论，作者认为BIR在复制障碍区域相关的基因组不稳定中发挥重要贡献。
据悉，Malkova实验室的博士生刘丽萍和Ira实验室的博士后严振鑫博士是本文的共同第一作者。贝勒医学院党巍巍实验室的孙鲁阳博士对本文亦有贡献。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-020-03172-w
文章来源：bioart
